¿Qué es cromatografía en fase reversa?

Desentrañando la Cromatografía de Fase Reversa: Una Separación Basada en la Hidrofobicidad

La cromatografía de fase reversa (CFR) es una técnica analítica fundamental y ampliamente utilizada para la separación de mezclas complejas. A diferencia de la cromatografía de fase normal, donde la fase estacionaria es polar y la fase móvil no polar, la CFR invierte este orden, empleando una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. Esta inversión es la clave para su capacidad de separar compuestos basándose en su hidrofobicidad, es decir, su aversión al agua.

Imaginemos una carrera de obstáculos donde las moléculas son los corredores. La pista es la columna cromatográfica, con una superficie no polar (la fase estacionaria) que simula un terreno difícil de atravesar para moléculas que “aman” el agua (hidrófilas). Por otro lado, las moléculas que “odian” el agua (hidrófobas) se sienten más cómodas en este terreno y se retrasan en la carrera. La fase móvil polar, como un flujo de agua, arrastra a los corredores (moléculas) a través de la pista. Las moléculas hidrófilas, con mayor afinidad por la fase móvil, viajan más rápido y eluyen (salen de la columna) primero. Las moléculas hidrófobas, interactuando fuertemente con la fase estacionaria no polar, se retienen por más tiempo y eluyen más tarde.

La fase estacionaria no polar suele consistir en cadenas de hidrocarburos de longitud variable, como cadenas de alquilo (C₈, C₁₈) inmovilizadas en una matriz de sílice. La fase móvil, por su parte, puede ser una mezcla de agua con solventes orgánicos miscibles como metanol, acetonitrilo o tetra hidrofurano (THF). La polaridad de la fase móvil se puede ajustar variando la proporción de agua y solvente orgánico, creando un gradiente de elución que optimiza la separación. Un gradiente implica un cambio gradual en la composición de la fase móvil a lo largo del tiempo, permitiendo la elución secuencial de compuestos con diferentes grados de hidrofobicidad.

La CFR presenta diversas ventajas:

• Versatilidad: Se puede aplicar a una amplia gama de analitos, desde moléculas pequeñas hasta macromoléculas como proteínas.
• Alta eficiencia: Permite separaciones de alta resolución, incluso en mezclas complejas.
• Sensibilidad: Se puede combinar fácilmente con detectores altamente sensibles, como los espectrómetros de masas (MS), para una cuantificación precisa.
• Reproducibilidad: Con una correcta estandarización de las condiciones, se obtienen resultados altamente reproducibles.

En resumen, la cromatografía de fase reversa es una técnica poderosa e indispensable en química analítica, bioquímica y otras disciplinas científicas, empleada para la separación, identificación y cuantificación de una gran variedad de compuestos basándose en sus diferencias de hidrofobicidad. Su versatilidad y eficiencia la convierten en una herramienta fundamental en numerosos análisis, desde el control de calidad en la industria farmacéutica hasta la investigación en proteómica y metabolómica.